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    試劑盒:顯色和比色分析

     更新時間:2018-08-27 點擊量:1214
       試劑盒:顯色和比色分析
      在試劑盒實驗中各種酶標儀性能都會有所不同,所以在使用中應詳細閱讀說明書,再進行下一步操作。
      自從20世紀60-70年代問世以來,Elisa法得到*科研工作者的認可及推崇,在歐美及中國獲得很大的推廣,尤其是國內生化領域的長足發展。試劑盒有著準確性高、靈敏度高、特異性強等很多的優點,它在檢測抗體、抗原等方面有很好的應用,深受廣大用戶朋友的喜愛。然而,在實驗過程中,也需要注意很多問題,特別是顯色、比色問題。
      顯色
      顯色是ELISA中的一步溫育反應,此時酶催化無色的底物生成有色的產物。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內,陰性孔可保持無色,而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行。在定量測定中,加入底物后的反應溫度和時間應按規定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行,時間一般不需要嚴格控制,有時可根據陽性對照孔和陰性對照孔的顯色適當縮短或延長反應時間,及時判斷。
      OPD(鄰苯二胺)底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深,再延長反應時間,可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色,顯色反應應避光進行,顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產物用硫酸終止后,顯色由橙黃色轉向棕黃色。
      TMB(四甲基聯苯胺)受光照的影響不大,可在室溫中置于操作臺上,邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩定性,宜在規定的適當時間閱讀結果。TMB經HRP作用后,約40分鐘顯色達,隨即逐漸減弱,2小時后即可*消退無色。TMB的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色,此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值。
      比色
      比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中。以軟板為載體的試驗,需先將板置于標準96孔的座架中,才可進行比色。在加底物液顯色前,先將軟板邊緣剪凈,這樣,此板就可*平妥坐入座架中。
      比色時應先以蒸餾水校零點,測讀底物孔(未經任何反應僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔),以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點,以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,然后進行計算。
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