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    全式金pEASY®-Blunt克隆試劑盒(CB101-01)產品介紹

     更新時間:2024-03-21 點擊量:167

    全式金pEASY®-Blunt克隆試劑盒(CB101-01)包含LacZ基因,在含有IPTG和X-gal的平板培養基上,可進行藍白斑篩選,適用于平端克隆。

    全式金pEASY®-Blunt克隆試劑盒(CB101-01)的產品組分包括pEASY®-Blunt Cloning Vector、Control Template、Control Primers、M13 Forward Primer、M13 Reverse Primer、Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell等,

    產品特點:

    快速:僅需5分鐘。

    簡單:加入片段即可。

    高效:陽性率高。

    提供氨芐青霉素和卡那霉素兩種篩選標記,便于根據實驗選擇篩選標記。

    測序引物:M13 Forward Primer,M13 Reverse Primer,T7 Promoter Primer。

    T7 Promoter用于體外轉錄。

    Trans1-T1感受態細胞轉化效率高,生長速度快,確??寺?,節約選時間。

    操作方法:

    1、PCR產物的制備

    (1)引物要求:引物不能磷酸化。

    (2)酶的選擇:擴增產物為平端的高保真DNA聚合酶,如FasP/,KD Plus DNA Polymerase。

    (3)反應條件:為了保證擴增產物的完整性,擴增反應需要5-10分鐘后延伸。反應結束后,電泳檢測PCR產物的量和質量如果擴增產物有多條帶,建議凝膠回收目的片段。

    2、克隆反應體系

    (1)加入

    組分

    規格

    PCR Product

    0.5-4μl

    pEASY®-Blunt Cloning   Vector

    1μl





    (2)輕輕混合,室溫(20℃-37℃℃) 反應5分鐘。反應結束后,將離心管置于冰

    3、推薦克隆反應條件

    · 最佳插入片段DNA量

    載體與片段摩爾比=1:7

    可以粗略地按照“1 kb 20 ng"的比例計算。(如1 kb加20 ng、1.5 kb加30 ng等)

    · 最佳載體使用量:1μl

    · 最佳反應體系:3-5 m,體積不足時可以補充無菌水。

    · 最佳反應時間

    (1)片段長度為0.1-1kb(含1 kb):5-10 min

    (2)片段長度為 1-2 kb(含2 kb):10-15 min

    (3)片段長度為 2-3 kb(含3 kb):15-20 min

    (4)片段長度為3 kb 以上:20-30 min

    · 最佳反應溫度:25℃,如片段是高GC含量,可以37℃反應。(推薦用PCR儀控溫)

    4、轉化

    (1) 加連接產物于50 m 7ans1-T1感受態細胞中(在感受態細胞剛剛解凍時加入連接產物),輕彈混勻,冰浴20-30分鐘。

    (2) 42℃水浴熱激30秒,立即置于冰上2分鐘。

    (3) 加250 ml平衡至室溫的SOC或LB培養基,200rpm、37℃培養1小時。

    (4) 取8u500 mM IPTG和40 wl 20 mg/mlX-gal混合,均勻地涂在準備好的平板上,37℃培養箱中放置30分鐘。

    (5)待IPTG和X-gal被吸收后,取200ml菌液均勻地涂在平板上,在37℃培養箱中過夜培養(為得到較多克隆,1.500xg離心1分鐘,棄掉部分上清,保留100-150 m,輕彈懸浮菌體,取全部菌液涂板)。

    產品選購:

    貨號

    產品名稱

    規格

    CB101-01

    pEASY®-Blunt Cloning Kit

    20 rxns



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