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    一步法RT-qPCR實驗優化小技巧

     更新時間:2024-05-16 點擊量:143

    常見的RT-qPCR流程一般分為RNA提取,逆轉錄、熒光定量PCR三個步驟,當有的課題需要對某物種進行多種處理后,檢測某個基因的表達水平,以驗證該基因應對不同脅迫壓力的耐受力;或者經某種病原菌侵染后,檢測寄主不同基因的表達水平,以探究可能涉及的通路及互作機理等……對于這幾類樣本數量較大,但樣本只需要檢測一次的實驗方案,我們常常推薦一步法RT-qPCR,即逆轉錄與熒光定量PCR配制一管體系,只需一次上機即可完成表達量的檢測。

    由于將RNA逆轉錄與熒光定量PCR的體系配制合為一步,那么對于實驗操作的精準度及污染控制就極為重要,針對一步法RT-qPCR的特殊性,以下總結了一步法RT-qPCR實驗優化技巧可有效提高實驗結果的穩定性及準確性。

    1. 目的片段選擇

    ① 選擇80-200 bp擴增子可保證PCR擴增效率zui大化

    ② 片段GC含量建議控制在40% ~ 60%

    ③ 避免擴增子與模板其他位置出現長片段的重復序列

    ④ 避免擴增子出現二級結構

    2. RNA模板制備

    ① 盡量選擇高產量、高純度的RNA提取試劑

    ② RNA可以保存在含有EDTA溶液 (1 × TE) 中,EDTA可螯合金屬離子來消除對RNase的催化作用,以此保證RNA的完整性

    ③ RNA提取后可以使用DNase I (ATG #E103) 消化基因組DNA殘留

    3. 引物設計

    ① 常規引物長度15-30 nt,理想的引物GC含量40-60%,Tm值盡量接近60℃,且上下游引物Tm值相差盡量3℃以內,避免4個重復性的堿基序列,尤其是4G堿基

    ② 引物濃度按說明書推薦值添加,引物投入量過多,可能產生引物二聚體或非特異擴增,熔解曲線會出現雜峰

    ③ cDNA為模板時,建議引物區域跨越內含子,這樣減少以基因組DNA模板進行擴增的假陽性

    4. 探針設計

    ① 常規探針長度15-30 nt,以保證熒光基團能夠有效猝滅,GC含量保持40-60%

    ② 一般情況下,非熒光猝滅基團比熒光猝滅基團更有信噪比

    ③ 避免5’端為G堿基,否則會猝滅熒光基團

    ④ 設計的探針應該結合到正義鏈或反義鏈上

    ⑤ 一般探針Tm值要比引物Tm值高5-10℃,保證引物結合前探針的全部序列與模板充分結合

    5. 多重擴增

    ① 避免探針、引物之間及目的序列之間沒有重疊序列

    ② 設計探針時,保證每個目的序列有唯yi的用于檢測的熒光基團

    ③ 根據實時定量PCR儀檢測范圍來選擇熒光基團,熒光報告基團的發射光譜不能有重疊

    ④ 在單重反應中檢測每一組引物/探針組合,以設置一個基線標準,確保在多重PCRCt值接近

    ⑤ 高豐度目的序列可搭配低強度熒光染料,低豐度目的序列則搭配高強度熒光染料

    6. 逆轉錄

     

    ① 一般建議逆轉錄這一步的反應溫度按照試劑說明書設置,對于具有復雜二級結構或高GC區域的模板,建議提高反應溫度,有助于提升擴增效率和靈敏度。

    7. 循環條件

    ① 一般情況下,按照說明書中的循環條件即可達到最佳效果

    ② 可以進行較長片段擴增 (>400 bp),但可能需要優化延伸時間

    ③ 對于大多數情況,40個循環是足夠的,極低起始量的可以進行45個循環

    8. 建立反應

    ① 為了達到最佳結果,在熱循環之前請將反應體系放在冰上

    ② 對于96孔板,推薦使用20 μl反應體系。使用384孔板,推薦10 μl反應體系

    ③ 每一個樣本應設置三個重復,保證每一個擴增子包含陰性對照 (NTC)

    ④ 為了避免交叉污染,熱循環前加入熱敏UDG,37℃處理10 min

    9. 檢測評估

    ① 確保至少三個10倍梯度稀釋模板的擴增效率達到90-110%,相關系數(R2) >0.99

    ② 通過產物的長度、測序或熔解曲線分析確認其特異性

    以上就是有關于一步法RT-qPCR實驗優化技巧的全部內容,如果你想了解更多請咨詢百奧創新客服!


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