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    脂質體轉染的原理與方法

     更新時間:2024-05-17 點擊量:48
      脂質體作為體內和體外輸送載體的工具,已經研究的十分廣泛,中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA,借助脂質膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體,DNA并沒有預先包埋在脂質體中,而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上,形成DNA-陽離子脂質體復合物,從而吸附到帶負電的細胞膜表面,經過內吞被導入細胞。下面讓我們一起來看看脂質體轉染的原理與方法吧!
      脂質體轉染操作步驟
      進行實驗之前,請先規劃好實驗,一般細胞轉染需要24h-72h,所以要充分了解細胞生長速度,計算所需脂質體和DNA的儲備量,并確認準備好所需試劑:Opti-MEM無血清培養基,Lipofectamine轉染試劑,以及DNA。
      1、細胞鋪板
     ?。?)一般會選擇復蘇細胞傳代3-4次,從解凍過程中恢復過來可以穩定生長的細胞進行細胞轉染,傳代次數高(&gt;30-40)時,細胞的生長速度和形態會改變。
     ?。?)如果提總蛋白,一般選擇六孔板進行轉染,因為轉染的細胞提取蛋白的總量能達到200ug,一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少。
     ?。?)傳代條件取決于所用的細胞系。對于快速生長的細胞,倍增時間為16小時(如HEK293)。對于生長緩慢的細胞,倍增時間為36小時(如原代細胞)。
     ?。?)轉染當天,將細胞鋪板。如果在轉染前一天或更早時間鋪板,轉染效率可能下降,如果是簡單細胞系的轉染,可以直接在前一天晚上鋪板,第二天來轉染。轉染時,細胞密度會影響轉染效率,細胞密度保持在匯合率為70-90%(這個前提是轉染24h,如果轉染48h則需要匯合率為50-70%),細胞的鋪板和轉染也可同時進行。
      2、細胞轉染
      吸去培養皿中的培養基,用PBS或者無血清培養基清洗一次。更換無血清培養基。準備轉染制備液,用滅菌后的EP管制備。以六孔板為例,A液:用200μl Opti-MEM稀釋4μg質粒;B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000,分別將A液、B液輕輕混勻,靜置5min,吸取B液加入至A液中,輕輕混勻,室溫靜置20min。加入轉染試劑到每個孔的培養基中,6h后,更換成完q培養基,繼續培養到24-48小時(不同的質粒和脂質體最佳搭配比例不同,轉染前,應該摸一個最佳配比。質粒:脂質體=1:1,1:1.5,1:2,1:2.5,1:3,1:3.5的梯度比例來檢測最佳轉染比例,一般質粒有帶熒光,可以通過觀察每組熒光強弱來判斷轉染效率)。以下為不同規格的培養板需要加DNA和lipo2000的量。
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